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水稻种子萌发过程中!!淀粉酶


植物学通报

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水稻种子萌发过程中 ! ! 淀粉酶 与萌发速率关系的分析 "
赵玉锦 王 台 !
(中国科学院植物研究所 北京 !"""#$)

摘要

用丙烯酰胺凝胶电泳技术和 $, ( ’()) 测定还原糖法, 对不同萌发时间农垦 %*+、 %&二硝基水杨酸

农垦 农垦 %*) 和农垦 %* 种子胚中" &淀粉酶同工酶及其酶活性变化进行研究。" , $- 小时萌发过程中, %*+ 和农垦 %*) " &淀粉酶活性高于农垦 %*。胚中检测出五条酶。./、 .0 和 .% 为上述种子共有酶带。 .$ 为农垦 %*+ 和农垦 %*) 特异性酶带。.! 为农垦 %* 特异性酶带。据此认为 " &淀粉酶对水稻种子萌发速 度起重要调控作用。.! 和 .$ 可能是调控种子发芽快慢的重要酶分子。 关键词 水稻, 种子萌发, &淀粉酶 "

"#$%&’(’ )* +,- .-%$+()#’,(/ 0-+1--# ! !"2&%$’- $#3 4-52(#$+(#6 .$+- )* .(7- 8--3’ 395(#6 +,- :5)7-’’ )* 8--3 4-52(#$+()#"
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# !

中国科学院生物技术与生物科学特别支持费 ();1#*&/&!0) 资助 通讯联系人,>E<7G:IP<8@X Q5MG7B/ S ><HI S 8>I S B8 作者简介: 赵玉锦, 女, 中科院植物所资源植物与发育分子生物学研究中心副研究员。 !#%" 年 - 月生, 收稿日期: 刘晖 /"""&"/&!0 接受日期: /"""&"%&!* 责任编辑:

9期

赵玉锦等: 水稻种子萌发过程中! !淀粉酶与萌发速率关系的分析

99=

发展, 糖对! 并进行 !淀粉酶 "#$%&’, "#$%(# 等基因表达的抑制引起了人们极大兴趣, 了深入广泛的研究 ( $)*+,- !" #$ , (../;01213*- !" #$ , (../; 4)5)6373 !" #$ , (../; %3 !" #$ , 。关于水稻种子成熟过程中碳水化合物含量及 ! (..8) !淀粉酶活性变化,种子萌发过程 中! 国内外已有一些文章发表 (高锦华和唐锡华, 殷宏章等, !淀粉酶同工酶的研究, (./9; , 但是关于水稻种子萌发速度与! (.:8; %);<+1-;- !" #$ , (.=>) !淀粉酶之间关系的研究尚未 见报道。 光敏核不育水稻农垦 :/? (简称 “@A:/?” ) 是从常规粳稻 ( %&’(# )#"*+# BC ;3D;E ,#-./*0# ) 农垦 :/ (简称 “@A:/” ) 大田中发现的雄性不育突变体 (石明松和邓景扬, , 有关其雄 (./8) 性发育及育性调节已有许多研究报道。育种学家在农垦 :/? 的应用研究中, 从农垦 :/? 不育群体中发现了可育植株, 与农垦 :/? 和农垦 :/ 比较, 这种可育植株的形态特征和光 周期反应与农垦 :/? 更接近, 但其雄性育性不受光周期调节, 在长短日照下均能正常结 实, 目前多数学者称之为农垦 :/F。在前期种子萌发实验中, 我们发现农垦 :/F 和农垦 表明农垦 :/F 和农垦 :/? 的种子可能有高 :/? 水稻种子萌发速度大约比农垦 :/ 快两天, 的萌发势。种子的高萌发势和快速萌发能确保种子在适宜条件下尽快发芽, 开始自营生 活, 减少育秧过程中种子腐烂和幼苗死亡,对于培育适于抛秧的壮苗尤为重要, 在农业生 产上有重要的经济意义。为了揭示农垦 :/F 和农垦 :/? 快速萌发的生化和分子机制, 我 们对农垦 :/F, 农垦 :/? 和农垦 :/ 三种水稻在不同萌发时间种子胚中 ! !淀粉酶活性变化 进行了研究。

! 材料与方法
!C! 实验材料 本实验以同一条件培养下获得的常规粳稻 ( %&’(# )#"*+# BC ;3D;E ,#-./*0# ) 农垦 :/ (简 称 “@A:/” ) , 光敏核不育水稻农垦 :/? ( 简称 “ @A:/?” ) 以及在农垦 :/? 不育群体中发现的 正常可育水稻农垦 :/F (简称 “@A:/F” ) 的种子为实验材料。 !C" 种子萌发实验 分别取籽粒饱满的 @A:/F、 浸种于培养瓶中, 保持适宜 @A:/? 和 @A:/ 种子各 (>> 粒, 水分, 置 9= GH 培养箱, 黑暗培养。此试验重复三次。以露白为标准, 观察不同培养时间 ((9, 种子的萌发率。 9I, &8, I/, 8>, =9 <) !C# ! !淀粉酶活性测定 采用 &, (’@?) 测定还原糖方法测定 ! (朱广廉等, 。 :!二硝基水杨酸 !淀粉酶活性 (..>) !$% ! &淀粉酶同工酶分析 取 9= GH 培养下、 不同浸种时间 (>, 农垦 :/F、 农垦 :/? 和农垦 :/ 种子的胚 (9, 9I, &8 <) 按 (: ( 加入样品提取液 (:> 11)N L B 4*+; , > C 9 J, ( K L M) > C 9I 1)N L B 蔗糖,9 11)N L B O’4# , , 在冰浴中匀浆, 用 Q)3-R $"(I C (( 离心机, 上清液置 S 9> EP / C >) (> >>> *E1 离心 (: 1+R, T 保存备用。 用聚丙烯酰胺凝胶垂直平板电泳分析 ! 凝 !淀粉酶同工酶。电泳分离胶浓度为 =U , 胶缓冲液为 > C (9 1)N L B 4*+;!> C >>: 1)N L B 柠檬酸 EP/ C .; 浓缩胶浓度为 IU , 凝胶缓冲液为 > C (9 1)N L B 4*+;! > C >>: 1)N L B 柠檬酸 EP 8 C /。分离胶和浓缩胶中均含有 > C (:U 的可溶性

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植物学通报

#0 卷

淀粉。电极缓冲液为 ! " # $%& ’ ( )*+,- ! " !# $%& ’ ( 甘氨酸 ./ 0 " 1, 点样量为 2! ! &。稳压 电泳时间约 2 4。 2!!3 进行电泳, 电泳毕, 将胶板置于 ! " #5 $%& ’ ( 醋酸缓冲液, 在 1678 保温 # " 5 4, 然后用 9 ./ 5 " ! 中, $$%& ’ ( :9 ; 5 $$%& ’ ( <: 显色碘液染色。

! 实验结果
!"# $%&’, $%&’( 和 $%&’) 的萌发势 在相同培养条件下, 农垦 50=、 农垦 50> 和农垦 50 种子之间的萌发势和萌发速率存在

着明显差异。培养 1? 4, 农垦 50= 和农垦 50> 的大部分种子已经开始露白, 萌发率分别为 萌发率为 !@ 。培养 20 4, 农垦 50 的 0!@ 和 A2@ 。而此时农垦 50 的种子还未开始萌动, 部分种子开始露白, 萌发率为 #9@ 。此时农垦 50= 和农垦 50> 的萌发率分别为 A!@ 和 比农垦 50 的萌发率大约高 0 倍。培养 69 4, 农垦 50= 和农垦 50> 的种子基本上全部 A2@ , 萌发, 萌发率分别为 A0@ 和 #!!@ ; 而农垦 50 的萌发率为 0?@ , 仅相当于浸种 1? 4 农垦 (表 #) 。由此可以看出, 农垦 50= 和农垦 50> 种子的萌发速度比 50= 和农垦 50 的萌发率 农垦 50 的大约快 1? ; 20 4。表明农垦 50= 和农垦 50> 有比较高的萌发势。
)BC&D #
品种 3B*+DGM

表 # 不同培养时间 $%&’)、 ( *) $%&’( 和 $%&’ 的萌发率 (@) )4D ED*$+FBG+%F *BGD %H ,DDI, %H JB.%F+KB *+KD L< 50=、L< 50> BFI L<50 BG I+HHD*DFG ED*$+FBG+%F G+$D"
时间 G+$D #9 4 ! ! ! 92 4 ! ! ! 1? 4 A2 0! ! 20 4 A2 A! #9 ?! 4 A? A? 6! 69 4 #!! A0 0?

L<50= L<50> L<50

!"!

萌动初期 $%&’, $%&’( 和 $%&’) 种子胚中 ! +淀粉酶活性变化 从图 # 可以看出, 在 ! ; 1? 4 浸种过程 中, L<50=、 L<50> 和 L<50 胚中 " -淀粉酶活 性有相同的变化趋势, 即干种子胚有较高的 浸种开始后酶活性呈下降趋 -淀粉酶活性, " 势, 至 924 降到低谷, 随后开始回升, 浸种 1?4 时酶活性明显提高。这种变化趋势反映了胚 中" -淀粉酶代谢变化的内在规律。干种子胚 中的" -淀粉酶来源于种子成熟过程中胚内储

图#

不同萌发时间 L<50=、 L<50> 和 L<50 种子胚中 -淀粉酶活性的变化 " =+E" # 84BFED, %H " -B$M&B,D BKG+N+GM +F ,DDI D$C*M%, %H !"#$%&’" *+KD L< 50=,L< 50> BFI L< 50 BG I+HHD*DFG ED*$+FBG+%F G+$D

存的" -淀粉酶蛋白质。水稻种子萌发初期是 一个吸水膨胀的物理过程, 此时胚中的 " -淀 粉酶被激活, 输入到胚乳, 用于催化胚乳中淀 粉的水解, 与之相对应的是胚中 " -淀粉酶蛋

白质量的减少和酶活性的下降, 浸种约两天后, 盾片或糊粉层细胞开始合成" -淀粉酶蛋白 徐是雄等, 。因此, 干种子胚中储藏的 " 质 (中山包, #A00; #A06) -淀粉酶对萌发初期物质与 能量代谢的快速启动和保证顺利发芽有重要作用, 是幼苗生长优势的重要生理基础之一。

#期

赵玉锦等: 水稻种子萌发过程中! -淀粉酶与萌发速率关系的分析

##G

在所测定的四个时间点 ( !, 中, 而 "#, #$, %&’) ()*+, ! -淀粉酶活性最高, ()*+. 的次之, 这与它们的萌发快慢与萌发势的高低有很好的对应关系 (表 "、 图 ") 。上述 ()*+ 的最低, 结果暗示! -淀粉酶活性的差异是造成 ()*+,、 ()*+. 和 ()*+ 萌发速率不同的主要原因之 一。 ! " # 不同萌发时间 $%&’, $%&’( 和 $%&’) ! *淀粉酶同工酶谱的变化 在 ! C %& 小时浸种期间, 分别在 !、 "#、 #$ 和 %& 小时取农垦 *+,、 农垦 *+. 和农垦 *+ 种 子的胚分析! -淀粉酶同工酶的变化。结果显 示胚中! -淀粉酶同工酶谱在不同时间没有明 显的变化。综合农垦 *+,、 农垦 *+. 和农垦 共鉴定出五条同工 *+ 胚! -淀粉酶同工酶谱, 酶带, 其 D, 值依次为 ! 1 ""、 ! 1 #E、 ! 1 %+、 ! 1 $% 和 ! 1 *!, 依照 D, 值取 “ 39:;365” 中的 “ F” 将它 们分 别 简 称 为 F"、 F#、 F%、 F$ 和 F*。农 垦 *+, 有 F#、 F%、 F$ 和 F*。农垦 *+. 的同工酶 谱与农垦 *+, 的相同。农垦 *+ 有 F"、 F#、 F$ 和 F*。比较农垦 *+,、 农垦 *+. 和农垦 *+ ! 淀粉酶同工酶谱可以看出, F#、 F$ 和 F* 是农 垦 *+,、 农垦 *+. 和农垦 *+ 共有的。 F% 是农 垦 *+, 和农垦 *+. 特有的。 F" 是农垦 *+ 特 有的。萌发实验结果已经表明农垦 *+, 和农
图# 不同萌发时间 ()*+,、 ()*+. 和 ()*+ -淀粉酶同 ! 工酶谱的变化 ,/01# 2’34056 78 ! -39:;365 /6754<:95 =3>>5?46 /4 655@ 59A?:76 78 !"#$%&’" ?/B5 () *+,,() *+. 34@ () *+ 3> @/885?54> 05?9/43>/74 >/95

垦 *+. 种子的萌发速率明显快于农垦 *+ 的, 大约快 %& 小时 (表 ") , 结合 ! -淀粉酶同工酶 谱结果, 我们推测 F" 和 F% 可能与种子发芽的快慢有内在联系。

#

讨论
种子发芽是从异养到自养的过渡, 对水稻而言, 适宜的水份、 温度和氧气是影响其正

常发芽的主要环境因子。种子对环境因子的反应因其遗传及生理上的差异而有很大不 同。萌发实验结果显示 ()*+, 与 ()*+. 有相近的萌发势, 二者的萌发速率大约比 ()*+ 的快 %& C $+ 小时, 表明调控 ()*+, ( 或 ()*+.) 与 ()*+ 发芽的基因之间有明显的差异。 水稻种子萌发过程中, 淀粉酶活性与胚乳消耗速率成正相关 (陆定志等, 。淀粉酶 "G+E3) 是水稻萌发过程中最主要的水解酶类, 而萌发初期起作用的又以 ! -淀粉酶为主。陆定志 等 ("G+EA) 在研究杂交水稻及其三系种子萌发过程中! 发现干种子中有 -淀粉酶的变化时, 干种子胚中 ! -淀粉酶活性。淀粉是水稻等禾谷类作物种子的主要储藏物质, -淀粉酶的 ! 存在能保证萌发初期物质与能量代谢的快速启动, 为蛋白质合成提供碳骨架和 FHI 的合 成提供底 物, 无 疑 是 种 子 顺 利 发 芽 和 幼 苗 生 长 优 势 的 重 要 生 理 基 础 之 一。 ()*+, 和 以 ()*+, 的酶活性为最高, 在随后 ()*+. 的干种子胚中的! -淀粉酶活性显著高于 ()*+, 的萌发过程中二者继续保持着这种高的活性。这与它们萌发的快慢有很好的对应关系。 暗示高的! 农垦 *+. 和农垦 *+ -淀粉酶活性是导致种子快速发芽的主要原因。农垦 *+,、

#)7

植物学通报

*& 卷

胚的! 农垦 %&’ 和农垦 !淀粉酶均有四条同工酶带, "#、 "$ 和 "% 是它们共有的。但是, 而农垦 %& 有特异性的酶带 "*。萌发实验显示农垦 %&’ 和农垦 %&( 有特异性的酶带 "), 均比农垦 %& 的快大约 )+ 小时 (表 *) , 这与它们是否有 ! %&( 有相近的萌发速率, !淀粉酶 同工酶带 ") 或 "* 有相关关系。推测 "* 和 ") 可能是影响水稻种子萌发快慢的主要酶 分子, 我们正在作进一步的实验证实这一推测。 参 考 文 献

高锦华 , 唐锡华 , *-&# . 高等植物胚胎的发育生物学研究 /. 水稻种胚发育过程中胚和胚乳内几种碳水化合物含量及 淀粉酶活力的动态 . 植物生理学报 , ! 0 #&% 1 #-$ 陆定志 , 施天生 , 陈龙飞 , *-&23. 杂交水稻及其亲本三系种子萌发过程中淀粉酶活性与胚乳物质消长的关系 . 杂交水 稻 , 4 ) 5 0 #* 1 #% 陆定志 , 杨煌峰 , 施天生 , 陈龙飞 , *-&26 . 杂交水稻干种子内存在! !淀粉酶 . 植物生理学报 , "# 0 $*& 1 $#* 石明松 , 邓景扬 . *-&+ . 湖北光敏感核不育水稻的研究及其利用途径 . 遗传学报 , "# 0 *72 1 **# 徐是雄 , 唐锡华 , 傅家瑞 , *-&2 . 种子生理研究进展 , 中山大学出版社 , #++ 1 #&* 殷宏章 , 余志新 , 李娉嫦 , 沈见钢 , *-%+ . 水稻籽粒成熟过程中淀粉合成及水解 酶活力的变化 . 实验生物学报 , $ 0 )$ 1 $$ 中山包 8 日 9 . *-&& . 发芽生理学 , 农业出版社 , )% 朱广廉 , 钟诲文 , 张爱琴 , *--7 . 植物生理学实验 , 北京大学出版社 , *2% 1 *2& :;<=> ? @, A<;;BC D ?, *-&7 . EFCF3;GHFC <> IHF JF;KB>3IB<> <L C3KF <L IHF D;3KB>F3F . ! "#$% &’() $% 0 $%& 1 %#& MHF> N, O3>J :, OP E, *--% . " JB66F;FQQB>!CIBKPQ3IFR P6BSPBIB>!G<>TPJ3IB>J F>UVKF JF>F BC B>W<QWFR B> 3QXH3!3KVQ3CF JF>F FYX;FC! CB<> B> ;BGF 3QFP;<>F. *+,-. /’+ 01’+ ) &’ 0 2&2 1 2-% DP6QF; ’, Z3QQ3 E, E<6F;IC [ Z, [3G<6CF> [ /, *--% . DB66F;FQQB>!;FJPQ3IFR FYX;FCCB<> <L 3 KV6 JF>F B> 63;QFV 3QFP;<>F GFQQC0 FWB! RF>GF L<; KV6 I;3>C3GIBW3IB<> <L 3 HBJH!X\ 3QXH3!3KVQ3CF JF>F X;<K<IF; . *+,-. "$++ , % 0 *&2- 1 -* ?36F;Q3>RI D , *-&7 . ]BF ZQF6F;CGHBGHI RFC D;3C!^>R<CCXF;KC 3QC ]B3CI3CF 3PCCGHFBRF>RFC ];PCF>JF=F6F. 0$2 3$4. 5$6 , ! 0 $7 1 $& ?FG_ D E, ?< @ ?, *--+ . DB66F;FQQB>!;FX;FCCB6QF JF>F FYX;FCCB<> B> 63;QV 3QFP;<>F Q3VF; . *+,-. /’+ 01’+ , #( 0 +** 1 #) !3KVQ3CF B> 63;QFV 3QFP! ?BJJB>C @ [ /, ‘=3; [ ", [3G<6CF> [ /, *-2+ . DB66F;FQQBG 3GBR F>H3>GFC IHF QFWFQ <L I;3>CQ3I36QF KEa" L<;! ;<>F Q3VF;C. 7,.42$ , &)( 0 *++ 1 *+A<;BI3 ", bKFKP;3 @, ZP;<VV3>3JB A, ’PICPH3;3 c, dF;3I3 d, c3K3J>FHB [, *--& . ’P>GIB<>3Q RBCCFGIB<> <L 3 CPJ3;!;FX;FCCFR 3Q! XH3!3KVQ3CF JF>F. 4 E3KV*" 5 X;<K<IF; B> ;BGF FK6;V<C. 890& :$.. , *&# 0 &* 1 &% @<V<LP_P Z, bKFKP;3 @, c3K3JPGHB , *--& . d;<K<IF; FQFKF>IC ;FSPB;FR L<F CPJ3;!;FX;FCCB<> <L IHF E3KV)] JF>F L<; 3QXH3!3KVQ3CF B> ;BGF. 890& :$.. , *&! 0 #2% 1 #&7 bKFKP;3 @, dF;3I3 d, ’PICPH3;3 c, c3K3JPGHB [, *--& . (PJ3; CF>CB>J 3>R 3QXH3!3KVQ3CF JF>F ;FX;FCCB<> B> ;BGF FK6;V<C. *+,-., , &(* 0 $#7 1 $#& cP ( A, eFF c M, ’3>J ( M, MH3> A @, ?=3 ( ’, eBP e ’, *--+ . (PJ3;C 3GI 3C CBJ>3Q K<QFGPQFC 3>R <CK<IBG3 I< ;FJPQ3IF IHF FY! X;FCCB<> <L 3QXH3!3KVQ3CF JF>FC 3>R KFI36<QBG 3GIBWBIBFC B> JF;KB>3IB>J GF;F3Q J;3B>C. *+,-. /’+ 01’+ ) #( 0 *#22 1 *#&c<CHBK3C3 @, @<K<_< \ , @3_3CHB " , *-27 . ^>UVKBG AFGH3>BCK <L (I3;GH :;F3_R<=> B> DF;KB>3IB>J EBGF (FFRC. ) .! !3KVQ3CF BC<UVKFC. *+,-. *#;61’+ , *) 0 +%7 1 +%$


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